PCR και NAAT: Τι Δείχνει η Μοριακή Εξέταση, Δείγμα, Αποτελέσματα και Ct

1Τι είναι η PCR και η NAAT

Η PCR, από τον όρο Polymerase Chain Reaction ή Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης, είναι εργαστηριακή τεχνική με την οποία ενισχύεται μία επιλεγμένη αλληλουχία γενετικού υλικού. Η ενίσχυση επιτρέπει την ανίχνευση ακόμη και όταν στο αρχικό δείγμα υπάρχει μικρή ποσότητα DNA ή RNA.

Ο όρος NAAT, από το Nucleic Acid Amplification Test, περιγράφει ευρύτερα τις δοκιμασίες που ενισχύουν νουκλεϊκά οξέα. Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται η PCR και άλλες τεχνολογίες, όπως ισοθερμικές μέθοδοι ενίσχυσης. Επομένως, μια εξέταση μπορεί να είναι NAAT χωρίς η τεχνική της να είναι κλασική PCR.

Στην καθημερινή επικοινωνία ο όρος «PCR» χρησιμοποιείται συχνά ως γενική ονομασία για τον μοριακό έλεγχο. Στην εργαστηριακή απάντηση, όμως, μεγαλύτερη σημασία έχουν:

• ο μικροοργανισμός ή η γενετική περιοχή που αναζητήθηκε,
• το βιολογικό δείγμα που εξετάστηκε,
• αν το αποτέλεσμα είναι ποιοτικό ή ποσοτικό,
• τα όρια ανίχνευσης και οι εγκεκριμένοι τύποι δείγματος της μεθόδου,
• η παρουσία κατάλληλων εσωτερικών μαρτύρων ελέγχου.

2PCR, RT-PCR, real-time PCR και qPCR: ποια είναι η διαφορά

Οι συντομογραφίες δεν χρησιμοποιούνται πάντοτε με απολύτως ίδιο τρόπο σε όλα τα έντυπα. Για αυτό η ερμηνεία πρέπει να βασίζεται στην πλήρη ονομασία της μεθόδου και όχι μόνο στα αρχικά «RT-PCR».

Επίσης, μια real-time PCR δεν είναι αυτομάτως κλινικά ποσοτική. Πολλά συστήματα χρησιμοποιούν real-time τεχνολογία αλλά δίνουν μόνο αποτέλεσμα «ανιχνεύθηκε» ή «δεν ανιχνεύθηκε». Πραγματικός ποσοτικός προσδιορισμός απαιτεί κατάλληλη βαθμονόμηση, πρότυπα αναφοράς και αποτέλεσμα σε μονάδες όπως αντίγραφα ή διεθνείς μονάδες ανά ml.

3Πότε χρησιμοποιείται ο μοριακός έλεγχος

Οι μοριακές εξετάσεις χρησιμοποιούνται όταν η άμεση ανίχνευση γενετικού υλικού μπορεί να απαντήσει σε ένα σαφές διαγνωστικό ή θεραπευτικό ερώτημα. Δεν αποτελούν όλες οι εφαρμογές την ίδια εξέταση και δεν ερμηνεύονται με τον ίδιο τρόπο.

Για τα χλαμύδια, για παράδειγμα, η βασική εξέταση είναι στοχευμένο NAAT σε κατάλληλο ουρογεννητικό ή εξωγεννητικό δείγμα. Δεν είναι ισοδύναμο με μία απλή καλλιέργεια ούρων ή μια γενική καλλιέργεια κολπικού επιχρίσματος.

4Ποιο δείγμα χρειάζεται για PCR ή NAAT

Το σωστό δείγμα είναι συχνά εξίσου σημαντικό με την ίδια τη μέθοδο. Ένα πολύ ευαίσθητο τεστ μπορεί να είναι αρνητικό όταν εξεταστεί υλικό από ανατομικό σημείο στο οποίο ο μικροοργανισμός δεν υπάρχει ή δεν αποβάλλεται σε επαρκή ποσότητα.

Στις σεξουαλικώς μεταδιδόμενες λοιμώξεις, η επιλογή του δείγματος πρέπει να ακολουθεί το σημείο της πιθανής έκθεσης. Ένα αρνητικό δείγμα ούρων δεν αποκλείει αυτόματα φαρυγγική ή πρωκτική λοίμωξη, εάν δεν εξετάστηκε το αντίστοιχο σημείο.

Αν υπάρχουν κολπικές εκκρίσεις, κνησμός ή εικόνα κολπίτιδας, η καλλιέργεια κολπικού ή τραχηλικού επιχρίσματος, η μικροσκόπηση και ο στοχευμένος μοριακός έλεγχος απαντούν σε διαφορετικά ερωτήματα. Δεν πρέπει να αντικαθιστά το ένα αυτόματα το άλλο.

5Πότε πρέπει να γίνει η λήψη

Δεν υπάρχει ένα ενιαίο «παράθυρο» που να ισχύει για όλες τις PCR. Ο κατάλληλος χρόνος εξαρτάται από τον μικροοργανισμό, το σημείο της λοίμωξης, την ημερομηνία έκθεσης ή έναρξης συμπτωμάτων, την ανοσολογική κατάσταση και το αν έχει αρχίσει θεραπεία.

Στις αναπνευστικές λοιμώξεις, η πιθανότητα ανίχνευσης συνδέεται συχνά με την έναρξη των συμπτωμάτων και το σημείο όπου πολλαπλασιάζεται ο ιός. Σε νόσο του κατώτερου αναπνευστικού, ένα αρνητικό δείγμα από το ανώτερο αναπνευστικό μπορεί να μην απαντά πλήρως στο κλινικό ερώτημα.

Στις σεξουαλικώς μεταδιδόμενες λοιμώξεις, η εξέταση αμέσως μετά από μία πιθανή έκθεση μπορεί να είναι πρόωρη. Ο χρόνος ελέγχου και η ανάγκη επανάληψης πρέπει να καθορίζονται ανά παθογόνο και όχι με έναν γενικό κανόνα για «όλα τα ΣΜΝ».

6Προετοιμασία και σωστή συλλογή δείγματος

Η νηστεία δεν αποτελεί γενικό κανόνα για τις εξετάσεις PCR. Η προετοιμασία εξαρτάται από το δείγμα και από τις οδηγίες του συγκεκριμένου εργαστηριακού συστήματος.

• Ακολουθήστε ακριβώς τις οδηγίες του εργαστηρίου για το δοχείο, τον στυλεό και το υλικό μεταφοράς.
• Μην χρησιμοποιείτε τυχαίο βαμβακοφόρο στυλεό ή δοχείο που δεν προορίζεται για τη συγκεκριμένη εξέταση.
• Για ούρα πρώτης ροής, συλλέγεται το αρχικό τμήμα της ούρησης και όχι δείγμα μέσης ροής, όταν αυτή είναι η οδηγία του τεστ.
• Για κολπικό ή τραχηλικό δείγμα, αναφέρετε πρόσφατη χρήση αντισηπτικών, κολπικών κρεμών, υπόθετων ή αντιβιοτικών.
• Για αναπνευστικό δείγμα, η σωστή τεχνική λήψης είναι απαραίτητη ώστε να συλλεχθεί επαρκές κυτταρικό και μικροβιακό υλικό.
• Το δείγμα πρέπει να αποθηκεύεται και να μεταφέρεται στις συνθήκες που προβλέπει το εργαστήριο.
• Ενημερώστε για την ημερομηνία έναρξης συμπτωμάτων, πιθανή έκθεση και τυχόν θεραπεία που έχει ήδη ξεκινήσει.

7Τι σημαίνει θετικό αποτέλεσμα

Θετικό ή «ανιχνεύθηκε» σημαίνει ότι στο συγκεκριμένο δείγμα ανιχνεύθηκε η γενετική αλληλουχία που αναζητούσε το τεστ. Η κλινική σημασία εξαρτάται από το παθογόνο και το είδος της εξέτασης.

Σε ένα κατάλληλα ληφθέν δείγμα για Chlamydia trachomatis, ένα θετικό NAAT αποτελεί ισχυρή ένδειξη λοίμωξης και απαιτεί ιατρική αντιμετώπιση. Σε άλλες περιπτώσεις, όμως, ένα θετικό αποτέλεσμα μπορεί να αντιπροσωπεύει:

• ενεργή λοίμωξη που εξηγεί τα συμπτώματα,
• ασυμπτωματική λοίμωξη,
• αποικισμό χωρίς κλινική νόσο,
• παραμονή γενετικού υλικού μετά την υποχώρηση της λοίμωξης ή μετά τη θεραπεία,
• σπάνια, επιμόλυνση ή μη ειδικό εργαστηριακό σήμα που χρειάζεται επανέλεγχο.

Η πιθανότητα ένα θετικό αποτέλεσμα να αντιπροσωπεύει πραγματική νόσο επηρεάζεται και από την προ της εξέτασης πιθανότητα. Όταν το παθογόνο είναι εξαιρετικά απίθανο, ένα ασθενές ή απρόσμενο θετικό αποτέλεσμα μπορεί να χρειάζεται επιβεβαίωση σύμφωνα με το πρωτόκολλο της μεθόδου.

8Αρνητικό αποτέλεσμα και ψευδώς αρνητική PCR

Αρνητικό ή «δεν ανιχνεύθηκε» σημαίνει ότι ο στόχος δεν ανιχνεύθηκε πάνω από το όριο της συγκεκριμένης μεθόδου στο δείγμα που εξετάστηκε. Δεν σημαίνει ότι αποδείχθηκε απόλυτα η απουσία λοίμωξης από ολόκληρο τον οργανισμό.

Συχνές αιτίες ψευδώς αρνητικού αποτελέσματος

• Η λήψη έγινε πριν αυξηθεί αρκετά το μικροβιακό ή ιικό φορτίο.
• Η λήψη έγινε αργά, όταν η αποβολή του παθογόνου είχε μειωθεί.
• Εξετάστηκε λάθος ανατομικό σημείο.
• Η ποσότητα του δείγματος ήταν ανεπαρκής.
• Η τεχνική συλλογής δεν απέδωσε αρκετά κύτταρα ή εκκρίσεις.
• Το δείγμα αποθηκεύτηκε ή μεταφέρθηκε σε ακατάλληλες συνθήκες.
• Υπήρχαν αναστολείς της ενίσχυσης μέσα στο δείγμα.
• Είχε προηγηθεί αντιβιοτική ή αντιική αγωγή.
• Το μικροβιακό φορτίο βρισκόταν κάτω από το όριο ανίχνευσης.
• Υπήρχε γενετική διαφοροποίηση στην περιοχή που στοχεύει το τεστ, ένα ενδεχόμενο που αξιολογείται από τους κατασκευαστές και τα εργαστήρια.

Όταν η κλινική υποψία παραμένει υψηλή, ο γιατρός μπορεί να ζητήσει νέο δείγμα, διαφορετικό ανατομικό σημείο, άλλη μοριακή μέθοδο, καλλιέργεια, αντιγόνο, ορολογικό έλεγχο ή συνδυασμό εξετάσεων.

9Άκυρο, αμφίβολο ή οριακό αποτέλεσμα

Δεν είναι όλα τα αποτελέσματα απλώς θετικά ή αρνητικά. Ανάλογα με το σύστημα, μπορεί να αναφερθεί αποτέλεσμα ως:

• Άκυρο: ο εσωτερικός μάρτυρας δεν λειτούργησε ή το δείγμα περιείχε αναστολείς.
• Αμφίβολο ή μη καθορισμένο: το σήμα δεν πληροί με σαφήνεια τα κριτήρια θετικότητας ή αρνητικότητας.
• Οριακό: ανιχνεύθηκε ασθενές σήμα κοντά στο όριο της μεθόδου.
• Μη αξιολογήσιμο: υπήρξε τεχνικό πρόβλημα, ανεπαρκής ποσότητα ή ακατάλληλο δείγμα.

Σε αυτές τις περιπτώσεις μπορεί να χρειαστεί επανάληψη από το ίδιο υλικό, νέα εκχύλιση ή νέο δείγμα. Η σωστή ενέργεια εξαρτάται από τις οδηγίες του κατασκευαστή, το παθογόνο και την κλινική κατάσταση.

Ένα άκυρο αποτέλεσμα δεν πρέπει να μετατρέπεται αυθαίρετα σε αρνητικό. Σημαίνει ότι η εξέταση δεν έδωσε επαρκή πληροφορία για ασφαλή ερμηνεία.

10Τι είναι η τιμή Ct και πώς ερμηνεύεται

Η τιμή Ct, από το cycle threshold, είναι ο αριθμός κύκλων ενίσχυσης που απαιτήθηκαν μέχρι το σήμα της real-time PCR να περάσει ένα καθορισμένο όριο. Γενικά, όταν όλες οι άλλες συνθήκες είναι ίδιες, χαμηλότερο Ct συνδέεται με μεγαλύτερη ποσότητα γενετικού στόχου στο συγκεκριμένο δείγμα και υψηλότερο Ct με μικρότερη ποσότητα.

Αυτό όμως δεν σημαίνει ότι το Ct είναι ένα άμεσο και καθολικό «ιικό φορτίο». Η τιμή επηρεάζεται από:

• το εργαστηριακό σύστημα και τα αντιδραστήρια,
• το γονίδιο ή την αλληλουχία που στοχεύεται,
• το όριο που έχει καθοριστεί από τον κατασκευαστή,
• την τεχνική και την ποσότητα του δείγματος,
• τη μεταφορά και την εκχύλιση του γενετικού υλικού,
• την παρουσία αναστολέων,
• το ανατομικό σημείο και τον χρόνο λήψης.

Οι τιμές Ct από διαφορετικές πλατφόρμες δεν είναι απαραίτητα συγκρίσιμες. Ακόμη και στο ίδιο δείγμα, δύο συστήματα μπορεί να δώσουν διαφορετικό Ct επειδή χρησιμοποιούν διαφορετικούς στόχους, όγκους, αντιδραστήρια και αλγορίθμους.

Για τον λόγο αυτό αρκετά εργαστήρια αναφέρουν μόνο το τελικό ποιοτικό αποτέλεσμα. Όταν το Ct δίνεται, πρέπει να αξιολογείται από επαγγελματία υγείας που γνωρίζει τη συγκεκριμένη μέθοδο.

11Ανίχνευση γενετικού υλικού και ενεργή νόσος

Η PCR απαντά πρωτίστως στο ερώτημα αν ανιχνεύθηκε ο συγκεκριμένος γενετικός στόχος μέσα στο συγκεκριμένο δείγμα. Δεν αποδεικνύει πάντοτε ότι ο μικροοργανισμός είναι ζωντανός, ότι πολλαπλασιάζεται ή ότι προκαλεί τα συμπτώματα.

Παραδείγματα διαφορετικής ερμηνείας

• Αναπνευστικοί ιοί: γενετικό υλικό μπορεί να παραμένει ανιχνεύσιμο για διάστημα μεγαλύτερο από την παρουσία βιώσιμου ιού.
• Clostridioides difficile: ένα μοριακό τεστ μπορεί να ανιχνεύσει τοξινογόνο στέλεχος σε άτομο με αποικισμό, χωρίς η διάρροια να προκαλείται απαραίτητα από αυτό.
• HPV: η ανίχνευση HPV DNA δείχνει παρουσία του ιού ή συγκεκριμένου γονοτύπου. Δεν σημαίνει ότι υπάρχει καρκίνος.
• CMV: η σημασία της ανίχνευσης εξαρτάται από το δείγμα, την ποσότητα, την ανοσολογική κατάσταση και τον λόγο για τον οποίο ζητήθηκε η εξέταση.
• Χλαμύδια: θετικό NAAT από κατάλληλο σημείο θεωρείται ένδειξη λοίμωξης, αλλά πολύ πρώιμη επανάληψη μετά τη θεραπεία μπορεί σε ορισμένες περιπτώσεις να ανιχνεύσει υπολειπόμενο γενετικό υλικό.

12Ποιοτική PCR, ποσοτική PCR και ιικό φορτίο

Το ιικό φορτίο έχει κλινική αξία μόνο όταν η εξέταση είναι ειδικά επικυρωμένη για ποσοτικό προσδιορισμό. Η απλή μετατροπή ενός Ct σε «αντίγραφα» χωρίς κατάλληλη καμπύλη βαθμονόμησης δεν αποτελεί αξιόπιστη ποσοτική μέτρηση.

Στην παρακολούθηση ασθενών είναι συνήθως προτιμότερο να χρησιμοποιείται η ίδια μέθοδος, ο ίδιος τύπος δείγματος και, όπου είναι δυνατόν, το ίδιο εργαστήριο. Με αυτόν τον τρόπο περιορίζονται οι διαφορές που οφείλονται στην πλατφόρμα και όχι στην πραγματική μεταβολή του φορτίου.

Στον CMV, για παράδειγμα, η ορολογία και ο μοριακός έλεγχος δεν απαντούν στο ίδιο ερώτημα. Η CMV IgG δείχνει κυρίως προηγούμενη ανοσολογική επαφή, ενώ η PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ανίχνευση ή ποσοτική παρακολούθηση CMV DNA σε ειδικά κλινικά πλαίσια.

13Multiplex μοριακά panels: περισσότερα παθογόνα δεν σημαίνει πάντα καλύτερη εξέταση

Τα multiplex panels αναζητούν ταυτόχρονα πολλά παθογόνα από το ίδιο δείγμα. Υπάρχουν αναπνευστικά, γαστρεντερικά, νευρολογικά και ουρογεννητικά panels.

Πιθανά πλεονεκτήματα

• Γρήγορος έλεγχος πολλών πιθανών αιτίων όταν τα συμπτώματα είναι μη ειδικά.
• Ανίχνευση συνλοιμώξεων σε επιλεγμένους ασθενείς.
• Μείωση του χρόνου μέχρι την αιτιολογική διάγνωση.
• Χρήσιμη εφαρμογή σε σοβαρή νόσο ή ειδικές ομάδες, όταν υπάρχει σαφής κλινική ένδειξη.

Περιορισμοί

• Μπορεί να ανιχνευθεί οργανισμός που δεν προκαλεί τα συμπτώματα.
• Μπορεί να εντοπιστεί αποικισμός ή παρατεταμένη αποβολή γενετικού υλικού.
• Ένα αρνητικό panel δεν αποκλείει παθογόνα που δεν περιλαμβάνονται σε αυτό.
• Δεν παρέχεται πάντοτε αντιβιόγραμμα ή πληροφορία για τη βιωσιμότητα του μικροοργανισμού.
• Η εκτεταμένη εξέταση χωρίς κλινική ένδειξη αυξάνει την πιθανότητα δυσνόητων ή μη αναμενόμενων ευρημάτων.

14PCR, καλλιέργεια, αντιγόνο και αντισώματα

Καμία μέθοδος δεν είναι πάντοτε «καλύτερη» από όλες τις άλλες. Για ορισμένες λοιμώξεις το NAAT αποτελεί την προτιμώμενη εξέταση. Σε άλλες, η καλλιέργεια είναι απαραίτητη για έλεγχο ευαισθησίας. Σε ορισμένες ιογενείς λοιμώξεις η ορολογία βοηθά στη χρονολόγηση ή στην εκτίμηση προηγούμενης έκθεσης.

Ο όρος «rapid test» περιγράφει κυρίως την ταχύτητα ή τη μορφή της εξέτασης και όχι μία ενιαία τεχνολογία. Υπάρχουν γρήγορα τεστ αντιγόνου αλλά και γρήγορες μοριακές NAAT. Επομένως δεν είναι σωστό να θεωρούμε ότι κάθε PCR είναι αργή ή ότι κάθε rapid test είναι τεστ αντιγόνου.

15Πότε επαναλαμβάνεται, πόσο αργεί και πόσο κοστίζει

Χρειάζεται πάντα επανάληψη;

Όχι. Η επανάληψη δεν πρέπει να γίνεται μηχανικά σε κάθε αρνητικό ή θετικό αποτέλεσμα. Μπορεί να εξεταστεί όταν:

• το πρώτο δείγμα ήταν ανεπαρκές, άκυρο ή λήφθηκε με αμφίβολη τεχνική,
• η εξέταση έγινε πολύ νωρίς σε σχέση με την πιθανή έκθεση,
• τα συμπτώματα επιμένουν ή επιδεινώνονται χωρίς εναλλακτική διάγνωση,
• χρειάζεται διαφορετικό ανατομικό δείγμα,
• υπάρχει απρόσμενο αποτέλεσμα με χαμηλή προ της εξέτασης πιθανότητα,
• το πρωτόκολλο συγκεκριμένης λοίμωξης απαιτεί test of cure ή ποσοτική παρακολούθηση.

Ο χρόνος για test of cure διαφέρει σημαντικά ανά λοίμωξη. Πολύ πρώιμη επανάληψη μπορεί να είναι παραπλανητική επειδή ενδέχεται να ανιχνευθεί υπολειπόμενο γενετικό υλικό.

Χρόνος αποτελέσματος

Δεν υπάρχει ενιαίος χρόνος «2 έως 24 ώρες» για όλες τις μοριακές εξετάσεις. Ορισμένες γρήγορες NAAT ολοκληρώνονται σε λιγότερο από μία ώρα, ενώ εξειδικευμένες ποσοτικές εξετάσεις ή δείγματα που αποστέλλονται σε κέντρο αναφοράς μπορεί να χρειαστούν περισσότερες ημέρες.

Ο συνολικός χρόνος εξαρτάται από την πλατφόρμα, την επεξεργασία του δείγματος, το πρόγραμμα εκτέλεσης, την ανάγκη επιβεβαίωσης και το αν η εξέταση πραγματοποιείται στο ίδιο εργαστήριο ή αποστέλλεται.

Κόστος

Δεν είναι ασφαλές να χρησιμοποιείται ένας σταθερός τιμοκατάλογος για τον γενικό όρο «PCR». Το κόστος εξαρτάται από το παθογόνο, τον αριθμό στόχων, αν η εξέταση είναι ποιοτική ή ποσοτική, αν πρόκειται για multiplex panel, την επείγουσα εκτέλεση και το αν απαιτείται αποστολή σε εξειδικευμένο εργαστήριο.

Πριν από τη λήψη πρέπει να επιβεβαιώνονται η ακριβής ονομασία της εξέτασης, το κατάλληλο δείγμα, ο αναμενόμενος χρόνος απάντησης και το ισχύον κόστος.

16Συχνές ερωτήσεις

17Κλείστε Ραντεβού και Βιβλιογραφία